表2 组间差异miRNA数比较Table 2 Comparison of the number of differentiated miRNAs among the groups组别比较差异miRNA总数上调miRNA数下调miRNA数模型组VS假手术组 续苓健骨方组VS模型组 续苓健骨方组VS假手术组835

表3 前10位差异表达 miRNAsTable 3 Top 10 of differential expressed miRNAs基因名称模型组VS 假手术组续苓健骨方组VS模型组 差异倍数P值差异倍数P值相关功能抑制胫骨神经再生腭裂发育[8]非酒精性脂肪肝非酒精性脂肪肝骨生成[9]神经性疼痛脊髓缺血损伤[10]骨形成[11]成骨细胞分化[12]药物治疗潜在靶点骨质疏松潜在标志物[13]促进骨质疏松[14]肥大细胞脱粒未知成骨分化[15]颚裂相关[16]成骨分化[17]骨生成[18]脊柱损伤修复[19]κB上游调节

2.3 实时荧光定量PCR验证miRNAs表达

根据miRNA测序的结果，从表3中随机选取了4个miRNA进行定量PCR验证，内参选择 snRNA U6。结果表明，rno-miR-136-3p、rno-miR-26b-5p在模型组中显著提高(P<0.01)，在续苓健骨方组中显著下降(P<0.01)；rno-miR-485-5p、rno-miR-138-5p在模型组中显著降低(P<0.01)，在续苓健骨方组中显著上升(P<0.01)。定量PCR的结果与测序结果一致(图1)。

图1 定量PCR验证部分测序结果Fig.1 Partial sequencing results verified by real-time PCR注：与假手术组比较，*P<0.01；与模型组比较，?P<0.01

2.4差异miRNAs靶基因预测及GO富集分析

基于miRNA数据库，从110条miRNA中选择经过续苓健骨方治疗后上调或及下调的top 10 miRNAs，进行靶基因预测，然后对靶基因进行Gene Ontology(GO)分析，包括分子功能(molecular function，MF)、细胞组成(cellular component，CC)及参与的生物学过程(biological process，BP)。图2分别列出了差异最显著的前10个GO条目。这些靶基因参与了蛋白结合、多肽结合、转录因子调节、RNA聚合酶转录因子活性等过程。

图2 GO分析柱形图 A：表达上调miRNAs靶基因参与的GO分析；B：表达下调miRNAs靶基因参与的GO分析Fig.2 Column map of enrichment analysis. A: Go analysis of target genes involved in up regulated miRNAs; B: Go analysis of target genes involved in down regulated miRNAs.

2.5 差异miRNAs靶基因信号通路分析

根据预测的靶基因，用其在KEGG数据库进行信号通路分析。分别选取前10个信号通路，根据P值绘制成柱状图(图3)。表达上调的miRNA的靶基因参与的信号通路包括甘油磷脂代谢通路、磷脂酰肌醇信号通路、HIF-1信号通路、甲状腺激素信号通路、Hedgehog信号系统、细胞内吞信号通路等；表达下调的miRNA的靶基因参与的信号通路主要包括内质网蛋白质加工信号通路、谷氨酸突触信号通路、GnRH信号通路、自噬调节、CAMP及MAPK等信号通路等。这些信号通路很可能参与了续苓健骨方治疗骨质疏松模型大鼠的治疗过程。

2.6 预测新的miRNAs

通过使用Dicer对miRNA前体处理的简单模型，miRDeep2预测新的miRNAs。表4列出了miRDeep2得分最高的10个新miRNAs。

图3 KEGG信号通路分析 A：表达上调miRNAs靶基因参与的信号通路；B：表达下调miRNAs靶基因参与的信号通路Fig.3 Pathway analysis on KEGG. A: signaling pathways involved in up regulated miRNAs; B: signaling pathways involved in down regulated miRNAs

表4 新miRNA表达数据展示Table 4 Display of expression data of new miRNAsTrack IDLocusmiRDeep2scoreTotal RCMature sequencechr3_chr3∶..:+.acaguagucugcacauugguuchr15_chr15∶..:-.ccaguauugacugugcugcugaachr7_chr7∶..:+.ucgaacuugacuaucuagachr1_3740chr1∶..:+_3736chr1∶..:+4_chr14∶..:-_chr18∶..:+gggcuggagagauggcucchr16_chr16∶..:+_chr18∶..:-_chr15∶..:-注：Total RC：对应miRNA系列读数。

3 讨论

中医药治疗骨质疏松的miRNA表达谱的研究较少。赵清等[20]应用Illumina高通量测序技术检测中药骨康治疗绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)SD大鼠血浆miRNAs，认为差异miRNAs可能在PMOP发生发展以及中药治疗中起重要的调控作用。严芳娜[21]用miRNA芯片检测黄精多糖对大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞和骨髓源性单核巨噬细胞诱导分化为破骨细胞过程中miRNAs表达谱的变化，认为miRNA的表达对诱导成骨细胞和破骨细胞均有重要作用。陈哲[22]运用高通量测序技术检测并qPCR验证滋肾降糖丸可能通过miRNAs对Wnt通路进行调控，进而影响成骨分化、实现防治糖尿病骨质疏松的作用。

本动物实验中，续苓健骨方组大鼠骨密度则显著提升。从差异miRNAs来看，续苓健骨方对在模型组出现异常表达的miRNAs起了较好的恢复作用。经12周的治疗后，共有110条miRNAs的异常表达得到纠正。与假手术组相比，续苓健骨方组仅有8个异常表达的miRNAs，这表明无论是骨密度还是miRNA层面，续苓健骨方对骨质疏松症均具有良好的治疗作用。

文章来源：《云南中医中药杂志》 网址: http://www.ynzyzyzz.cn/qikandaodu/2021/0305/649.html