骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种以骨量减低、骨细微结构退化，骨强度降低为特征的骨代谢疾病。2010-2016年，我国老年人的整体发病率是36%，而在绝经后老年女性的发病率高达49%[1]，严重影响中老年人的健康。骨碎补是一味治疗骨质疏松的常用中药，可以促进成骨[2-3]；也可以抑制破骨细胞的分化及成熟[4]，但具体作用机制尚不完全明确。在本实验中，笔者研究骨碎补对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrowstromal cells，BMSCs)Wnt/β-Catenin及OPG/RANKL/RANK信号通路的影响，及其对破骨细胞分化、成熟的作用，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物

分离BMSCs用实验动物，为6月龄健康雌性SD大鼠(SPF级)，体重(315.) g，诱导培养破骨细胞用实验动物，为出生14～20 d的SD大鼠。均购自朋悦(济南)公司，合格证号：SCXK(鲁)。

1.2试剂耗材

低糖DMEM培养基(DMEM-LG)(美国Hyclone公司)、胎牛血清(FBS)(美国Hyclone 公司)、0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA(美国Hyclone 公司)、TRIpure Reagent(批号AX，北京艾德莱生物科技有限公司)、Wnt10b、β-Catenin、OPG、RANKL及GAPDH抗体(Abcam公司)、辣根酶标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥)、伊红染色液、苏木素染色液(上海碧云天生物技术有限公司)、OPG、RANKL ELISA试剂盒(武汉基因美公司)、大鼠破骨细胞诱导培养基、大鼠破骨细胞完全培养基(武汉普诺赛公司)。

1.3主要仪器设备

研究用万能级显微镜(OLYMPUS，日本奥林巴斯公司)、CO2培养箱(上海力康发展有限公司)、实时荧光定量PCR 仪(LightCy-cler480II，瑞士)、酶联免疫仪(Biotek Elx800，美国伯腾仪器有限公司)，微量紫外可见光分光光度计(凯奥/K5600，北京凯奥科技发展有限公司)、温度梯度PCR仪(TP600，日本TAKARA)、垂直蛋白电泳仪(VE-，上海天能)、流式细胞仪(FACSVE RSE，美国BD)、多色荧光成像系统(Fusion Fx7，法国VILBER)、Transwell 小室(北京康宁公司，中国)。

1.4实验方法

1.4.1动物分组、造模及鉴定：背侧双切口切除双侧卵巢建立骨质疏松模型[5]，假手术组仅摘除卵巢周围少量脂肪组织。术后适应性饲养8周，健康大鼠随机分为3组，各组16只，分为实验组(OVXDF)、模型组(OVX)、假手术组(SHAM)。实验组参考本课题组前期实验[3]，根据动物与人体的每千克体重剂量折算后，按照4.8 g/只剂量给予骨碎补水煎液灌胃(相当于人体千克体重每日用药的10倍)，模型组及假手术组用0.9%生理盐水3.0 mL/只灌胃，每日两次，连续12周。灌胃结束时将大鼠麻醉，使用MEDILINK-MEDIX90骨密度仪自带软件测量大鼠L4～5、双侧股骨骨密度。

的分离培养、形态观察及鉴定：(1)BMSCs分离及培养。采用全骨髓贴壁筛选法进行BMSCs的分离及培养，倒置相差显微镜观察细胞增殖及形态变化并拍照，待原代细胞增殖到90%融合时，按1∶3比例进行传代，继续培养，待细胞增殖到90%融合时，再次传代培养。(2)BMSCs鉴定。取各组融合状况优良的P3代BMSCs，消化、离心，弃上层液体，无菌PBS漂洗2遍，用2 mL PBS重悬细胞，平均分配到3个1.5 mL的EP管中，一管不加任何抗体作空白对照，另两管分别加入抗体CD44(Alexa Fluor 647)2 μL、CD45(FITC)2 μL并做好标记，4 ℃避光孵育35 min，1 000 r/min，4 ℃，离心5 min，无菌PBS清洗2遍后，制成500 μL单细胞悬液，移入专用管中，上机分析CD44、CD45表达情况。

1.5BMSCs与破骨细胞共培养体系的建立

采用分离骨髓单核细胞的方法获得破骨细胞前体细胞，将出生14～20 d的实验大鼠断颈处死，取股骨和胫骨，剪开骨髓腔，用MEMα培养基多次冲洗，收集冲洗液，反复吹打，收集滤液，离心后弃上清液，保留细胞沉淀。将4 mL大鼠淋巴细胞分离液加入到离心管，其上加入已用4 mL MEMα重悬细胞沉淀；离心后吸取中间白膜层细胞到15 mL离心管内，加入10 mL PBS 稀释，再次离心，弃上清，保留细胞沉淀，用大鼠破骨细胞诱导培养基重悬细胞沉淀，按2×103/cm2种于6孔板的Transwell下室以破骨细胞诱导剂培养。将上述80%细胞融合的间充质干细胞制成细胞悬液，以1×104/cm2加入6孔板上的Transwell上室进行培养。下室于共培养第3、5、7天以破骨细胞诱导培养基重换液，第9天更换大鼠破骨细胞完全培养基进行培养，此后每3 d换药一次。上室以BMSCs培养液同步换液。根据BMSCs来源将共培养细胞分为：实验组+破骨细胞(OVXDF+OC)、模型组+破骨细胞(OVX+OC)、假手术组+破骨细胞(SHAM+OC)。

1.6破骨细胞形态观察、鉴定及计数

共培养后第3、7、12、16天于倒置相差显微镜下观察下室细胞形态。共培养后第12天对下室细胞进行HE及TRAP染色(根据TRAP染色染色试剂盒说明)。

文章来源：《云南中医中药杂志》 网址: http://www.ynzyzyzz.cn/qikandaodu/2021/0316/675.html