0 引言 Introduction

骨质疏松症是一种全身性骨骼疾病，其特点是骨质量降低，骨组织微结构破坏，导致骨脆性增加，骨折风险增加[1-2]。随着人口老龄化的增长，骨质疏松症在国内中老年人中的发病率逐渐增高，骨质疏松症使患者的行动受到较为严重的影响，骨折的发生率相对较高，从而影响患者的生活质量，已成为一个严重的社会问题[3-5]。

斑马鱼是近年来被广泛用于疾病模型建立和药物发现的重要模式生物[6]，其骨骼发育和哺乳动物相似，具有骨形成和骨吸收活动的完整体系，为建立斑马鱼骨质疏松、骨关节炎等模型提供了生理及遗传学依据，是骨骼研究的理想模式动物[7-9]。

临床发现，高龄骨质疏松患者明显存在肝郁肾虚征象，作者自拟补肾调肝方治疗高龄骨质疏松患者在临床上应用多年，补肾调肝方能明显改善高龄骨质疏松症患者疼痛症状和中医临床症状，临床疗效肯定[10-12]，但缺乏相关的实验依据。文章旨在通过建立斑马鱼骨质疏松模型对补肾调肝方的安全性、药效进行研究，为早期、快速评价补肾调肝方的抗骨质疏松作用提供实验依据，为斑马鱼骨质疏松模型评价中药抗骨质疏松的可靠性与合理性提供参考。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 观察性实验。

1.2 时间及地点 于2019年6至8月广州中医药大学科技创新中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 实验所用6月龄野生型AB斑马鱼购买于南京一树梨花公司(由广州中医药大学临床药理研究所陈桐楷课题组提供)。

1.3.2 药物与试剂 MS-222(大连美伦，MB2517，中国)；泼尼松龙(上海笛柏生物科技有限公司，K，中国)；阿仑膦酸钠(国药准字H，中国)；茜素红S染色液(Leagene，DS0059，中国)；多聚甲醛(广州晶欣生物科技有限公司，JX0100，中国)；二甲基亚砜(Sigma，D2650，美国)。

1.3.3 主要仪器 DMi8倒置荧光显微镜(Leica，D-)；三气培养箱(上海力申科学仪器有限公司，HF100)；分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司公司，BSA224S-CW)。

1.3.4 药物溶液的配制

泼尼松龙溶液的配制：参考葛静等[13]建立的方法，准确称取泼尼松龙90 mg，加入10 mL二甲基亚砜溶解，混匀即得25 mmol/L泼尼松龙储备液，使用时用配置好的E3按照1∶1 000稀释，终浓度为25 μmol/L。

中药提取物的配制：将浓缩的中药补肾调肝方分别用配置好的泼尼松龙溶液稀释到不同终质量浓度：10，50，100，250，500 mg/L，备用。

阿仑膦酸钠的配制：将阿仑膦酸钠加入超纯水使溶解，配制成50 g/L的母液，用配置好的泼尼松龙溶液稀释到终质量浓度为100 mg/L，备用。

1.3.5 药材提取 补肾调肝方药材均由广州中医药大学第三附属医院提供，骨碎补15 g、狗脊15 g、白芍30 g、柴胡12 g、郁金15 g、当归15 g、玫瑰花12 g、川楝子12 g、川芎10 g、白术15 g、合欢皮15 g、菊花15 g、石菖蒲15 g、甘草10 g。以上中药投入5 L的带冷凝管的圆底烧瓶，加入1 600 mL蒸馏水，浸泡8 h，武火煮开，然后调至文火，微沸30 min，趁热过滤，滤液备用，滤渣加入800 mL蒸馏水再次煎熬，沸腾后20 min过滤，将收集的2次滤液合并浓缩至1 mL等于1 g原药材的浸膏，待其冷却后放入冰箱备用。

1.4 实验方法

1.4.1 斑马鱼的饲养及胚胎的收集 6月龄野生型AB斑马鱼养殖于(28.0±1)℃的环境中，保证14 h光照10 h黑暗，pH=6.8-7.5，给予充足的氧气，每天喂食2次。挑选适龄的繁殖斑马鱼，使其自由追逐交配产卵，收集30 min内产出的健康的卵。清洗挑选过的鱼卵均匀放置于直径为10 cm的无菌的培养皿中加入20 mL的E3培养基(5 mmol/L NaCl、0.17 mmol/L KCl、0.33 mmol/L CaCl2、0.33 mmol/L MgSO4、0.5 mg/L亚甲基蓝)[14]，放于(28.) ℃的恒温培养箱中培养。

1.4.2 补肾调肝方的安全性评价 选取健康的5 hpf(受精后小时数，hours post fertilization)的鱼卵均匀地分到24孔板中，每孔20枚鱼卵。将用E3溶液配置好的不同质量浓度的补肾调肝方水溶液(10，50，100，250，500 mg/L)分别加入到相应的孔中，每孔2 mL溶液，每个浓度设置2个复孔。分别于24，48，72，96 hpf观察胚胎的发育情况，并统计的胚胎累计存活率及孵化率。存活率、孵化率的计算方式为该时间点每孔的存活、孵化鱼卵的累计个数除以鱼卵总数(20)乘以100%。

1.4.3 斑马鱼骨质疏松模型的建立及分组 实验分为对照组、模型组、阿仑膦酸钠(100 mg/L)组以及补肾调肝方10 mg/L组、50 mg/L组、100 mg/L组、250 mg/L组、500 mg/L组。将发育至72 hpf的斑马鱼幼虫均匀的分布到12孔板中，每孔20条，2孔为一组共40条幼虫。每孔加入相应的溶液4 mL，对照组阿仑膦酸钠组及各浓度的补肾调肝方溶液均含0.5%二甲基亚砜，所有组每24 h更换一次溶液，直到斑马鱼发育到8 dpf(受精后天数，days post fertilization)。

文章来源：《云南中医中药杂志》 网址: http://www.ynzyzyzz.cn/qikandaodu/2020/0722/383.html