1.4.4 斑马鱼头骨茜素红染色 将8 dpf大的斑马鱼幼虫安乐死(10X MS-222麻醉)。以40 g/L多聚甲醛固定24 h，随机每组抽取8条幼虫进行茜素红染色，对染色的斑马鱼幼虫进行显微镜镜检。运用Image J计算斑马鱼头部骨骼染色面积及吸光度。

1.5 主要观察指标 ①斑马鱼幼鱼的生长发育情况；②斑马鱼胚胎的累计存活率；③斑马鱼胚胎的孵化率；④斑马鱼头骨茜素红染色面积；⑤斑马鱼头骨茜素红染色累计吸光度值。

1.6 统计学分析 所有的数据使用GraphPad Prism 7软件进行分析，统计方法采用One-way ANOVA，数据呈现形式为±s，P< 0.05认为差异有显著性意义。

实验动物造模目的、技术方法等相关问题造模目的： 探讨补肾调肝方的安全性及其对泼尼松龙诱导的骨质疏松性斑马鱼的治疗作用研究问题借鉴已有标准动物模型造模：参考葛静等[9]的方法建立斑马鱼骨质疏松模型选择动物的条件： 受精后3 d发育健康的斑马鱼卵模型与所研究疾病的关系：用 25 μmol/L泼尼松龙诱导斑马鱼可模拟人体骨质疏松动物来源及品系： 野生型AB斑马鱼，购买于南京一树梨花公司造模技术描述： 将发育至72 hpf的斑马鱼幼虫均匀的分布到12孔板中，每孔20条，两孔为一组共40条幼虫。每孔加入含25 μmol/L泼尼松龙的E3溶液4 mL，每24 h更换一次溶液，直到斑马鱼发育到8 dpf造模主要诱导用药： 泼尼松龙造模后实验观察指标： 头骨茜素红染色面积及累计吸光度值造模后动物处理： 麻醉处死动物，固定，茜素红染色，显微镜镜检伦理委员会批准： 实验符合广州中医药大学的相关伦理要求

2 结果 Results

2.1 斑马鱼幼鱼的生长发育情况 显微镜观察结果发现，24及48 hpf时胚胎未孵化成幼鱼，胚胎形态正常，未见明显畸形。72及96 hpf时胚胎孵化成幼鱼，各脏器发育基本完全，鱼体透明，在载玻片上易侧卧，显微镜下检视脏器形态清楚、直观，心脏区域心包未见肿大，各组斑马鱼幼鱼均无明显畸形。因此，与对照组相比，不同质量浓度补肾调肝方对斑马鱼幼鱼均未见明显毒性作用，结果见图1。

2.2 存活率结果 不同质量浓度补肾调肝方对斑马鱼幼鱼存活率的影响见图2。药物处理96 hpf后，低浓度补肾调肝方(10，50，100，250 mg/L)对斑马鱼存活率无明显影响，而当药物浓度到达500 mg/L时，斑马鱼存活率出现下降，差异有显著性意义(P< 0.05)，提示高质量浓度补肾调肝方可以影响斑马鱼存活。

2.3 孵化率结果 不同质量浓度补肾调肝方对斑马鱼胚胎孵化率的影响见图3。药物处理72 hpf后，低浓度补肾调肝方(10，50，100，250 mg/L)对斑马鱼孵化率无明显影响，而当药物浓度到达500 mg/L时，斑马鱼孵化率出现下降，差异有显著性意义(P< 0.05)，提示高质量浓度补肾调肝方可以影响斑马鱼胚胎孵化。

图1 斑马鱼模型的安全性评价显微图Figure 1 Micrograph of safety evaluation of zebrafish model图注：图中所示为不同质量浓度补肾调肝方对斑马鱼生长发育的影响。与对照组相比，不同质量浓度补肾调肝方对斑马鱼生长发育未见明显影响。hpf为受精后小时数

图2 各质量浓度补肾调肝方组处理96 hpf斑马鱼的存活率Figure 2 The survival rate of zebrafish juveniles 96 hours after fertilization in each concentration group图注：与对照组比较，aP< 0.05

图3 各质量浓度组处理72 hpf斑马鱼孵化率Figure 3 The hatching rate of zebrafish juveniles 72 hours after fertilization in each concentration group图注：与对照组比较，aP< 0.05

图4 各组斑马鱼幼鱼(8 dpf)头骨茜素红染色的显微成像结果Figure 4 Microscopic view of alizarin red-stained whole-mount preparations of zebrafish cranium (8 days after fertilization)图注：25 μmol/L泼尼松龙成功诱导斑马鱼骨量减少，补肾调肝方对泼尼松龙诱导的斑马鱼骨量减少有逆转作用

图5 各处理组斑马鱼头骨茜素红染色面积的比较Figure 5 Alizarin red-stained area of zebrafish cranium in each group图注：与对照组比较，aP <0.001；与模型组比较，bP< 0.01，cP<0.005，dP< 0.001。染色面积用Image J分析，默认以像素为单位

图6 各处理组斑马鱼头骨茜素红染色累计吸光度的比较Figure 6 Cumulative absorbance value of zebrafish cranium detected by alizarin red staining图注：与对照组比较，aP <0.001；与模型组比较，bP< 0.01，cP<0.005，dP< 0.001

2.4 补肾调肝方对泼尼松诱导的斑马鱼骨质疏松的影响各组斑马鱼幼鱼(8 dpf)头骨茜素红染色的显微成像结果见图4，图像分析软件分析结果见图5，6。与对照组相比，模型组的骨染色矿化面积和累积吸光度值明显降低，差异有显著性意义(P

文章来源：《云南中医中药杂志》 网址: http://www.ynzyzyzz.cn/qikandaodu/2020/0722/383.html