结果与结论：①低浓度补肾调肝方对胚胎存活率及孵化率无影响，而高浓度补肾调肝方可降低胚胎存活率及孵化率；②25 μmol/L泼尼松龙能成功诱导斑马鱼骨量显著丢失；③与模型组比较，50，100，250 mg/L的补肾调肝方可对抗泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松，并呈浓度依赖性；低质量浓度无明显的抗骨质疏松作用，高质量浓度抗骨质疏松作用呈下降趋势；④结果表明，25 μmol/L泼尼松龙能成功诱导斑马鱼骨质疏松模型的建立；成功评价了补肾调肝方的安全性，补肾调肝方在50 mg/L开始出现抗骨质疏松作用，在250 mg/L具有最为显著的抗骨质疏松作用。

BACKGROUND:Our previous studies have found thatBushen Tiaoganprescription can significantly reduce pain and improve the clinical symptoms of traditional Chinese medicine in elderly patients with clinical effect is positive, but there is no relevant experimental evidence.

OBJECTIVE:To explore the safety ofBushen Tiaoganprescription and its therapeutic effect on prednisolone-induced osteoporosis.

METHODS:The zebrafish juveniles 5 hours after fertilization were evenly distributed into 24-well plates at a density of 20 per concentrations ofBushen Tiaoganprescription (crude drug concentrations 10, 50, 100, 250, 500 mg/L) were added to the corresponding development of the embryos was observed at 24, 48, 72, 96 hours after fertilization, and the cumulative survival rate and hatching rate were used to evaluate the safety ofBushen zebrafish juveniles 3 days after fertilization were randomly divided into blank control group (0.5% dimethyl sulfoxide), 25 μmol/L prednisolone model group, alendronate sodium positive drug group andBushen Tiaoganprescription (10, 50, 100, 250, 500 mg/L) groups, with 40 in each culture fluid was changed every day and executed at the juveniles were dyed using alizarin red for microscopic detection and digital imaging and the bone staining area was quantitatively analyzed by image software to evaluate the anti-osteoporosis activity ofBushen Tiaoganprescription.

RESULTS AND CONCLUSION:The low-concentrationBushen Tiaoganprescription had no effect on embryo survival rate and hatching rate,while the high-concentrationBushen Tiaoganprescription could reduce embryo survival rate and hatching , 25 μmol/L, was able to successfully induce significant loss of bone mass in with the model group, 50, 100 and 250 mg/LBushen Tiaoganprescription could resist prednisolone-induced zebrafish osteoporosis in a concentration-dependent low concentrations,there was no significant anti-osteoporosis effect, and at high concentrations, anti-osteoporosis effect showed a downward findings indicate that 25 μmol/L prednisolone successfully induces the establishment of zebrafish osteoporosis model, and successfully evaluates the initial safety ofBushen Tiaoganprescription begins to show an anti-osteoporosis effect at 50 mg/L,and has the most significant anti-osteoporosis effect at 250 mg/L.

文章快速阅读：文题释义：斑马鱼骨质疏松模型：斑马鱼具有体型小、易养殖、成本低、发育迅速、产卵量大、对外界环境反应迅速、基因组与人类同源性高等特点而被广泛应用于科研领域。泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型具有简单、高效、高灵敏及低成本的优势，可克服哺乳动物实验强度大、耗时长、低灵敏、用样量大，以及细胞模型条件要求苛刻、作用环节单一等缺陷。该模型有望突破中药体内抗骨质疏松活性高效评价的制约，为早期、快速评价中药及其复方的抗骨质疏松活性提供思路与方法。补肾调肝方：为自拟方，临床上应用多年，能明显改善高龄骨质疏松症患者疼痛症状和中医临床症状，方中包括骨碎补、狗脊、白芍、柴胡、郁金、当归、玫瑰花、川楝子、川芎、白术、合欢皮、菊花、石菖蒲、甘草，全方共奏补肾壮骨、疏肝解郁、理气止痛之功。0 引言 Introduction骨质疏松症是一种全身性骨骼疾病，其特点是骨质量降低，骨组织微结构破坏，导致骨脆性增加，骨折风险增加[1-2]。随着人口老龄化的增长，骨质疏松症在国内中老年人中的发病率逐渐增高，骨质疏松症使患者的行动受到较为严重的影响，骨折的发生率相对较高，从而影响患者的生活质量，已成为一个严重的社会问题[3-5]。斑马鱼是近年来被广泛用于疾病模型建立和药物发现的重要模式生物[6]，其骨骼发育和哺乳动物相似，具有骨形成和骨吸收活动的完整体系，为建立斑马鱼骨质疏松、骨关节炎等模型提供了生理及遗传学依据，是骨骼研究的理想模式动物[7-9]。临床发现，高龄骨质疏松患者明显存在肝郁肾虚征象，作者自拟补肾调肝方治疗高龄骨质疏松患者在临床上应用多年，补肾调肝方能明显改善高龄骨质疏松症患者疼痛症状和中医临床症状，临床疗效肯定[10-12]，但缺乏相关的实验依据。文章旨在通过建立斑马鱼骨质疏松模型对补肾调肝方的安全性、药效进行研究，为早期、快速评价补肾调肝方的抗骨质疏松作用提供实验依据，为斑马鱼骨质疏松模型评价中药抗骨质疏松的可靠性与合理性提供参考。1 材料和方法 Materials and 设计 时间及地点 于2019年6至8月广州中医药大学?材料1.3.1 实验动物 实验所用6月龄野生型AB斑马鱼购买于南京一树梨花公司(由广州中医药大学临床药理研究所陈桐楷课题组提供) 药物与试剂 MS-222(大连美伦，MB2517，中国)；泼尼松龙(上海笛柏生物科技有限公司，K，中国)；阿仑膦酸钠(国药准字H，中国)；茜素红S染色液(Leagene，DS0059，中国)；多聚甲醛(广州晶欣生物科技有限公司，JX0100，中国)；二甲基亚砜(Sigma，D2650，美国) 主要仪器 DMi8倒置荧光显微镜(Leica，D-)；三气培养箱(上海力申科学仪器有限公司，HF100)；分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司公司，BSA224S-CW) 药物溶液的配制泼尼松龙溶液的配制：参考葛静等[13]建立的方法，准确称取泼尼松龙90 mg，加入10 mL二甲基亚砜溶解，混匀即得25 mmol/L泼尼松龙储备液，使用时用配置好的E3按照1∶1 000稀释，终浓度为25 μmol/L。中药提取物的配制：将浓缩的中药补肾调肝方分别用配置好的泼尼松龙溶液稀释到不同终质量浓度：10，50，100，250，500 mg/L，备用。阿仑膦酸钠的配制：将阿仑膦酸钠加入超纯水使溶解，配制成50 g/L的母液，用配置好的泼尼松龙溶液稀释到终质量浓度为100 mg/ 药材提取 补肾调肝方药材均由广州中医药大学第三附属医院提供，骨碎补15 g、狗脊15 g、白芍30 g、柴胡12 g、郁金15 g、当归15 g、玫瑰花12 g、川楝子12 g、川芎10 g、白术15 g、合欢皮15 g、菊花15 g、石菖蒲15 g、甘草10 g。以上中药投入5 L的带冷凝管的圆底烧瓶，加入1 600 mL蒸馏水，浸泡8 h，武火煮开，然后调至文火，微沸30 min，趁热过滤，滤液备用，滤渣加入800 mL蒸馏水再次煎熬，沸腾后20 min过滤，将收集的2次滤液合并浓缩至1 mL等于1 g原药材的浸膏，待其?实验方法1.4.1 斑马鱼的饲养及胚胎的收集 6月龄野生型AB斑马鱼养殖于(28.0±1)℃的环境中，保证14 h光照10 h黑暗，pH=6.8-7.5，给予充足的氧气，每天喂食2次。挑选适龄的繁殖斑马鱼，使其自由追逐交配产卵，收集30 min内产出的健康的卵。清洗挑选过的鱼卵均匀放置于直径为10 cm的无菌的培养皿中加入20 mL的E3培养基(5 mmol/L NaCl、0.17 mmol/L KCl、0.33 mmol/L CaCl2、0.33 mmol/L MgSO4、0.5 mg/L亚甲基蓝)[14]，放于(28.) 补肾调肝方的安全性评价 选取健康的5 hpf(受精后小时数，hours post fertilization)的鱼卵均匀地分到24孔板中，每孔20枚鱼卵。将用E3溶液配置好的不同质量浓度的补肾调肝方水溶液(10，50，100，250，500 mg/L)分别加入到相应的孔中，每孔2 mL溶液，每个浓度设置2个复孔。分别于24，48，72，96 hpf观察胚胎的发育情况，并统计的胚胎累计存活率及孵化率。存活率、孵化率的计算方式为该时间点每孔的存活、孵化鱼卵的累计个数除以鱼卵总数(20)乘以100% 斑马鱼骨质疏松模型的建立及分组 实验分为对照组、模型组、阿仑膦酸钠(100 mg/L)组以及补肾调肝方10 mg/L组、50 mg/L组、100 mg/L组、250 mg/L组、500 mg/L组。将发育至72 hpf的斑马鱼幼虫均匀的分布到12孔板中，每孔20条，2孔为一组共40条幼虫。每孔加入相应的溶液4 mL，对照组阿仑膦酸钠组及各浓度的补肾调肝方溶液均含0.5%二甲基亚砜，所有组每24 h更换一次溶液，直到斑马鱼发育到8 dpf(受精后天数，days post fertilization) 斑马鱼头骨茜素红染色 将8 dpf大的斑马鱼幼虫安乐死(10X MS-222麻醉)。以40 g/L多聚甲醛固定24 h，随机每组抽取8条幼虫进行茜素红染色，对染色的斑马鱼幼虫进行显微镜镜检。运用Image J计算斑马鱼头部骨骼染 主要观察指标 ①斑马鱼幼鱼的生长发育情况；②斑马鱼胚胎的累计存活率；③斑马鱼胚胎的孵化率；④斑马鱼头骨茜素红染色面积；⑤斑马鱼头骨茜素红染色?统计学分析 所有的数据使用GraphPad Prism 7软件进行分析，统计方法采用One-way ANOVA，数据呈现形式为±s，P< 0.05认为差异有显著性意义。实验动物造模目的、技术方法等相关问题造模目的： 探讨补肾调肝方的安全性及其对泼尼松龙诱导的骨质疏松性斑马鱼的治疗作用研究问题借鉴已有标准动物模型造模：参考葛静等[9]的方法建立斑马鱼骨质疏松模型选择动物的条件： 受精后3 d发育健康的斑马鱼卵模型与所研究疾病的关系：用 25 μmol/L泼尼松龙诱导斑马鱼可模拟人体骨质疏松动物来源及品系： 野生型AB斑马鱼，购买于南京一树梨花公司造模技术描述： 将发育至72 hpf的斑马鱼幼虫均匀的分布到12孔板中，每孔20条，两孔为一组共40条幼虫。每孔加入含25 μmol/L泼尼松龙的E3溶液4 mL，每24 h更换一次溶液，直到斑马鱼发育到8 dpf造模主要诱导用药： 泼尼松龙造模后实验观察指标： 头骨茜素红染色面积及累计吸光度值造模后动物处理： 麻醉处死动物，固定，茜素红染色，显微镜镜检伦理委员会批准： 实验符合广州中医药大学的相关伦理要求2 结果 斑马鱼幼鱼的生长发育情况 显微镜观察结果发现，24及48 hpf时胚胎未孵化成幼鱼，胚胎形态正常，未见明显畸形。72及96 hpf时胚胎孵化成幼鱼，各脏器发育基本完全，鱼体透明，在载玻片上易侧卧，显微镜下检视脏器形态清楚、直观，心脏区域心包未见肿大，各组斑马鱼幼鱼均无明显畸形。因此，与对照组相比，不同质量浓度补肾调肝方对斑马鱼幼鱼均未见明显毒性作用，?存活率结果 不同质量浓度补肾调肝方对斑马鱼幼鱼存活率的影响见图2。药物处理96 hpf后，低浓度补肾调肝方(10，50，100，250 mg/L)对斑马鱼存活率无明显影响，而当药物浓度到达500 mg/L时，斑马鱼存活率出现下降，差异有显著性意义(P< 0.05)，提示高质量浓度补肾调肝方?孵化率结果 不同质量浓度补肾调肝方对斑马鱼胚胎孵化率的影响见图3。药物处理72 hpf后，低浓度补肾调肝方(10，50，100，250 mg/L)对斑马鱼孵化率无明显影响，而当药物浓度到达500 mg/L时，斑马鱼孵化率出现下降，差异有显著性意义(P< 0.05)，提示高质量浓度补肾调肝方可以影响斑马鱼胚胎孵化。图1 斑马鱼模型的安全性评价显微图Figure 1 Micrograph of safety evaluation of zebrafish model图注：图中所示为不同质量浓度补肾调肝方对斑马鱼生长发育的影响。与对照组相比，不同质量浓度补肾调肝方对斑马鱼生长发育未见明显影响。hpf为受精后小时数图2 各质量浓度补肾调肝方组处理96 hpf斑马鱼的存活率Figure 2 The survival rate of zebrafish juveniles 96 hours after fertilization in each concentration group图注：与对照组比较，aP< 0.05图3 各质量浓度组处理72 hpf斑马鱼孵化率Figure 3 The hatching rate of zebrafish juveniles 72 hours after fertilization in each concentration group图注：与对照组比较，aP< 0.05图4 各组斑马鱼幼鱼(8 dpf)头骨茜素红染色的显微成像结果Figure 4 Microscopic view of alizarin red-stained whole-mount preparations of zebrafish cranium (8 days after fertilization)图注：25 μmol/L泼尼松龙成功诱导斑马鱼骨量减少，补肾调肝方对泼尼松龙诱导的斑马鱼骨量减少有逆转作用图5 各处理组斑马鱼头骨茜素红染色面积的比较Figure 5 Alizarin red-stained area of zebrafish cranium in each group图注：与对照组比较，aP <0.001；与模型组比较，bP< 0.01，cP<0.005，dP< 0.001。染色面积用Image J分析，默认以像素为单位图6 各处理组斑马鱼头骨茜素红染色累计吸光度的比较Figure 6 Cumulative absorbance value of zebrafish cranium detected by alizarin red staining图注：与对照组比较，aP <0.001；与模型组比较，bP< 0.01，cP<0.005，dP< 0.0012.4 补肾调肝方对泼尼松诱导的斑马鱼骨质疏松的影响各组斑马鱼幼鱼(8 dpf)头骨茜素红染色的显微成像结果见图4，图像分析软件分析结果见图5，6。与对照组相比，模型组的骨染色矿化面积和累积吸光度值明显降低，差异有显著性意义(P < 0.00)，表明25 μmol/L泼尼松龙能够成功诱导斑马鱼骨量减少；与泼尼松龙模型组比较，100 mg/L阿仑膦酸钠溶液组中骨染色面积和累计吸光度值显著升高(P<0.001)。补肾调肝方组中，在一定质量浓度内，随着补肾调肝方质量浓度增加，斑马鱼头骨染色面积和累计吸光度值均随之增加。10 mg/L补肾调肝方溶液中斑马鱼头骨染色面积和累计吸光度值与泼尼松龙组比较差异无显著性意义(P>0.05)；补肾调肝方质量浓度为50 mg/L时，染色面积和累计吸光度值呈现极显著性增加(P< 0.01)；质量浓度为100 mg/L时，染色面积和累计吸光度值呈现极显著性增加(P< 0.005)；质量浓度为250 mg/L时，染色面积和累计吸光度值呈现极显著性增加(P< 0.001)；当质量浓度增加到500 mg/L时，染色面积和累计吸光度值与模型组比较差异有显著性意义(P< 0.005)，但其染色面积和累计吸光度值均比250 mg/L时下降。结果说明50，100，250 mg/L的补肾调肝方可对抗泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松，并呈浓度依赖性；低质量浓度则无明显的抗骨质疏松作用，而高质量浓度组斑马鱼的头骨染色面积和累积吸光度值却呈下降趋势。3 讨论 Discussion现代医学认为，骨质疏松症是一种全身性骨骼疾病，由于骨矿物质密度低，骨微结构、矿化受损或骨强度降低而增加了骨折的风险[15]。骨质疏松症属于中医学“骨痹”“骨痿”范畴，历代医家对其病机的认识主要包括肾精亏虚，脾胃失调，瘀阻脉络，肝失疏泄[16-19]。其中肾中精气的盛衰是根本，脾胃功能失调导致气血不足[20]，肝失疏泄导致气血瘀滞是诱发骨质疏松的重要原因，若肝失疏泄，气血运行不畅，其发病机制可能是淤血导致骨内微循环障碍，使新骨形成及旧骨的吸收减少[21-22]。因此，骨质疏松治疗的主要原则是补肾调肝。补肾调肝方中骨碎补为君药，起补肾益精之效；狗脊补肝肾、强腰膝；白芍养血柔肝、缓急止痛；柴胡疏肝解郁，郁金行气解郁、活血止痛；当归补血；川芎活血祛瘀、行气开郁、祛风止痛；玫瑰花行气解郁、和血、止痛；川楝子舒肝、行气止痛，共为臣药。白术健脾益气，既能实土以御木侮，且使营血生化有源；石菖蒲开窍、豁痰、理气、活血、散风、祛湿；菊花散风清热、平肝阳；合欢皮解郁、和血、宁心、安神为佐药。甘草调和诸药为使药。全方共奏补肾壮骨、疏肝解郁、理气止痛之功[23]。作为研究工具，斑马鱼因具有体型小、易养殖、成本低、发育迅速、产卵量大、体外受精、体外发育、胚胎透明、对外界环境反应迅速、基因组与人类同源性高等特点而被广泛应用于科研领域[24-25]，近年来糖皮质激素诱导的斑马鱼骨质疏松模型已被逐步应用于药物筛选当中[26-28]。泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型具有简单、高效、高灵敏及低成本的优势，克服哺乳动物实验强度大、耗时长、低灵敏、用样量大，以及细胞模型条件要求苛刻、作用环节单一等缺陷[29]。该模型有望突破中药在体抗骨质疏松活性高效评价的制约，为早期、快速评价中药及其复方的抗骨质疏松活性提供思路与方法。但目前斑马鱼的中药给药换算方法仍处于探索阶段，在斑马鱼实验之后，应当再搭配使用其他动物模型，特别是哺乳动物(如小鼠等)模型进行进一步的验证[30]。此次研究发现，阿仑膦酸钠作为临床当中常用的抗骨质疏松药物，对泼尼松导的斑马鱼骨质疏松有较好的治疗作用。此次实验用斑马鱼骨质疏松模型成功评价了补肾调肝方防治骨质疏松的作用以及补肾调肝方的初步安全性。数据显示，补肾调肝方在50 mg/L开始出现抗骨质疏松作用，在250 mg/L具有最为显著的抗骨质疏松作用；在质量浓度增加至500 mg/L时，头骨染色面积和累计吸光度值有所降低，表明药物的抗骨质疏松作用不是随着质量浓度增大而效应增强的，这可能与药物在斑马鱼体内的吸收和代谢有关，具体原因有待进一步研究。质量浓度在500 mg/L以上对斑马鱼幼鱼的心血管发育虽未见明显影响，但会降低斑马鱼胚胎的累计存活率及孵化率。结果显示，抗骨质疏松有效剂量浓度与出现中毒症状浓度相差近10倍，提示补肾调肝方治疗骨质疏松的临床剂量范围内是安全的。此次研究为斑马鱼模型高效评价中药抗骨质疏松抗效果的合理性、可靠性提供了依据，后期将以补肾调肝方对骨质疏松症基因及其蛋白表达的干预作用为主，探讨补肾调肝方产生抗骨质疏松症作用的机制。4 参考文献 References[1]ENSRUD KE, CRANDALL Int Med.2017;167(3):17-32.[2]PASKINS Z, JINKS C, MAHMOOD W, et priorities for osteoporosis and fracture research: results from a general population ;12(1):45.[3]薛鹏,李玉坤.2017年版《原发性骨质疏松症诊疗指南》解读[J].河北医科大学学报,2018,39(1):1-6.[4]姚立彬,李百占,张立强,等.补肾益气化瘀汤治疗原发性骨质疏松症的临床疗效观察[J].中国药物与临床,2017,17(2):282-283.[5]柯呈辉,何立江,吴文华.双膦酸盐防治骨质疏松性骨折的研究进展[J].中国骨质疏松杂志,2019,25(6):870-874.[6]KARI G, RODECK U, DICKER : an emerging model system for human disease and drug Pharmacol ;82(1):70-80.[7]FLEMING A, SATO M, GOLDSMITH P.High -throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with Biomol ; 10(8):823-831.[8]WAGNER TU, RENN J, RIEMENSPERGER T, et al.The teleost fish medaka (Oryzias Latipes) 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文章来源：《云南中医中药杂志》 网址: http://www.ynzyzyzz.cn/qikandaodu/2020/0722/383.html