1.7酶联免疫吸附剂测定(ELISA)检测共培养体系中的OPG、RANKL情况

共培养后第12天，收集Transwell下室细胞上清液，分别按照OPG、RANKL的ELISA试剂盒说明书操作，于450 nm波长检测各孔的光密度值并代入标准曲线计算蛋白质表达水平。

1.8实时荧光定量PCR观察BMSCs Wnt10b、β-catenin、RANKL、OPG mRAN及RANKL/OPG

共培养后第12天后，收集Transwell上室BMSCs，提取总RNA并检测纯度达标，取罗氏反转录试剂盒，按步骤冰上依次配置各组RNA反转录体系并于PCR仪中反应合成cDNA, 配置20 μL总体积的PCR反应体系(SYBR GreenⅠ10 μL，上游引物和下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，DEPC水7 μL)在LightCycler?480设备中进行实时荧光定量PCR反应条件：①预变性：95 ℃ 10 min 1个循环；扩增循环：②扩增 95 ℃ 10 s；③退火55 ℃ 10 s；④延伸72 ℃ 20 s，②至④为45个循环；溶解曲线：⑤95 ℃ 5s；⑥65 ℃ 60 s；⑦97 ℃ continous，⑤至⑦为1个循环；保温：40 ℃ 10 s 1个循环。实验结束后，导出记录各样本的ct值，在Excel中以β-actin作为内参基因对各组待测样品进行RNA总量校正，采用2-ΔΔct法计算各组基因的相对表达量，并进行统计学分析。目标基因引物序列见表1。

表1引物序列Table1The sequences of primers基因序列产物长度(bp)Wnt10bF:5’-CCCCGGGACATCCAGGCGAGAAT-3’R:5’-GGACGTAGGCGGGGCTGGAAAACT-3’245β-catenin F:5’-TGGTGGGCTGCAGAAAATGGTT-3’R:5’-ACGATGGCCGGCTTGTTGC-3’246OPGF:5’-TCCCTTGCCCTGACTACTCTTAT-3’R:5’-GAACCCATCCGGACATCTTTT-3’260RANKLF:5’-CGAGCGCAGATGGATCCTAACAGA-3’R:5’-TCCCTTTGCACGGCCCCTTGAA-3’179

1.9蛋白质印迹法(Western blot)观察Wnt10b、β-Catenin、RANKL、OPG的情况

共培养后第12天，收集Transwell上室BMSCs，消化、离心、重悬、再离心，去上清，入含PMSF的裂解液，冰上持续裂解30 min，离心取上清，BCA法测定蛋白浓度，添加蛋白上样缓冲液(5×)，水浴锅100 ℃煮沸10 min，冰上降温，稍离心，-20 ℃保存，制备凝胶，依次进行转膜，封闭，用稀释后的Wnt10b、β-Catenin、OPG、RANKL、GAPOH抗体，摇床震荡1 h后，4 ℃条件下过夜，次日洗涤后二抗孵育1 h，洗涤，加入显影液孵育2 min，在Bio-Rad凝胶成像分析系统中曝光保存图像后，通过Image J软件对蛋白条带进行分析。

1.10统计分析方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。数据以表示，各组间比较采用完全随机设计的方差分析，P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1骨密度检查结果

灌胃12周后，OVX、OVXDF组大鼠L4～5及双侧股骨骨密度较SHAM组明显下降，以OVX组最低，差异具有统计学意义(P<0.05)，表明造模成功(见图1)。

2.2BMSCs形态观察及鉴定

形态观察：BMSCs培养至第3代时，细胞生长迅速，同时贴壁细胞成倍数增加，当细胞达到80%～90%融合时，其形态更加均一，呈纤维样或宽大扁平不规则样，排列密集紧凑，呈放射状或旋涡状(见图 2)。

图1大鼠L4～5及双侧股骨骨密度 mineral density L4-5 and the bilateral femurs in rats

图2各组大鼠BMSCs第3代细胞形态 A：SHAM组，B：OVXDF组，C：OVX组Fig.2The cell morphology of the third passage of BMSCs in rats of each group. A: SHAM; B: OVXDF; C: OVX

2.2.2流式细胞仪检测：经流式分析检测，结果显示三组BMSCs CD44的表达率为阳性，CD45的表达率为阴性。结合培养时细胞形态学的观察，说明本实验采用全骨髓分离培养方法得到的BMSCs纯度较高，质量可靠。见图 3。

图3流式细胞仪鉴定结果 of flow cytometry注：CD44表达阳性，CD45表达阴性。

2.3破骨细胞的形态观察及鉴定

2.3.1破骨细胞活体观察：倒置相差显微镜显示下室内单核细胞随着培养时间的延续逐渐融合呈周围有伪足，胞浆有空泡的多核细胞，数量逐渐增多，体积及细胞核数增多，在混合培养后第7～9天达到高峰。三组比较OVX+OC多核细胞出现最早，个数最多，凋亡时间最晚， OVXDF+OC组次之，SHAM+OC组最低。见图4。

图4破骨细胞的形态观察 A：SHAM+OC组，B：OVXDF+OC组，C：OVX+OC组 observation of osteoclasts. A: SHAM+OC; B: OVXDF+OC; C: OVX+OC

2.3.2破骨细胞的鉴定及计数：HE染色可见破骨细胞呈浅粉红色，体积较大，胞浆颗粒均匀、细小，核仁染色呈浅蓝色，可见多个细胞核，细胞膜周围可见伪足(图5A)。TRAP染色观察见破骨细胞体积较大，呈酒红色，胞质均匀，可见多核，核呈蓝色。周围可见伪足(图5B)。TARP染色(+)、细胞核内可见多核，表明诱导所得细胞为破骨细胞。

在200倍镜下随机分析10个视野的TRAP(+)且胞内≥3个细胞核的多核细胞数，显示与去卵巢后灌胃大鼠BMSCs共培养的破骨细胞(OVXDF+OC)数量较单纯模型组+破骨细胞(OVX+OC)明显减少。三组比较，SHAM+OC组

文章来源：《云南中医中药杂志》 网址: http://www.ynzyzyzz.cn/qikandaodu/2020/1004/469.html