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骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种以骨量减低、骨细微结构退化，骨强度降低为特征的骨代谢疾病。2010-2016年，我国老年人的整体发病率是36%，而在绝经后老年女性的发病率高达49%[1]，严重影响中老年人的健康。骨碎补是一味治疗骨质疏松的常用中药，可以促进成骨[2-3]；也可以抑制破骨细胞的分化及成熟[4]，但具体作用机制尚不完全明确。在本实验中，笔者研究骨碎补对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrowstromal cells，BMSCs)Wnt/β-Catenin及OPG/RANKL/RANK信号通路的影响，及其对破骨细胞分化、成熟的作用，并探讨其可能的作用机制。1 材料与方法1.1实验动物分离BMSCs用实验动物，为6月龄健康雌性SD大鼠(SPF级)，体重(315.) g，诱导培养破骨细胞用实验动物，为出生14～20 d的SD大鼠。均购自朋悦(济南)公司，合格证号：SCXK(鲁)试剂耗材低糖DMEM培养基(DMEM-LG)(美国Hyclone公司)、胎牛血清(FBS)(美国Hyclone 公司)、0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA(美国Hyclone 公司)、TRIpure Reagent(批号AX，北京艾德莱生物科技有限公司)、Wnt10b、β-Catenin、OPG、RANKL及GAPDH抗体(Abcam公司)、辣根酶标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥)、伊红染色液、苏木素染色液(上海碧云天生物技术有限公司)、OPG、RANKL ELISA试剂盒(武汉基因美公司)、大鼠破骨细胞诱导培养基、大鼠破骨细胞完全培养基(武汉普诺赛公司)主要仪器设备研究用万能级显微镜(OLYMPUS，日本奥林巴斯公司)、CO2培养箱(上海力康发展有限公司)、实时荧光定量PCR 仪(LightCy-cler480II，瑞士)、酶联免疫仪(Biotek Elx800，美国伯腾仪器有限公司)，微量紫外可见光分光光度计(凯奥/K5600，北京凯奥科技发展有限公司)、温度梯度PCR仪(TP600，日本TAKARA)、垂直蛋白电泳仪(VE-，上海天能)、流式细胞仪(FACSVE RSE，美国BD)、多色荧光成像系统(Fusion Fx7，法国VILBER)、Transwell 小室(北京康宁公司，中国)实验方法1.4.1动物分组、造模及鉴定：背侧双切口切除双侧卵巢建立骨质疏松模型[5]，假手术组仅摘除卵巢周围少量脂肪组织。术后适应性饲养8周，健康大鼠随机分为3组，各组16只，分为实验组(OVXDF)、模型组(OVX)、假手术组(SHAM)。实验组参考本课题组前期实验[3]，根据动物与人体的每千克体重剂量折算后，按照4.8 g/只剂量给予骨碎补水煎液灌胃(相当于人体千克体重每日用药的10倍)，模型组及假手术组用0.9%生理盐水3.0 mL/只灌胃，每日两次，连续12周。灌胃结束时将大鼠麻醉，使用MEDILINK-MEDIX90骨密度仪自带软件测量大鼠L4～5、双侧股骨骨密的分离培养、形态观察及鉴定：(1)BMSCs分离及培养。采用全骨髓贴壁筛选法进行BMSCs的分离及培养，倒置相差显微镜观察细胞增殖及形态变化并拍照，待原代细胞增殖到90%融合时，按1∶3比例进行传代，继续培养，待细胞增殖到90%融合时，再次传代培养。(2)BMSCs鉴定。取各组融合状况优良的P3代BMSCs，消化、离心，弃上层液体，无菌PBS漂洗2遍，用2 mL PBS重悬细胞，平均分配到3个1.5 mL的EP管中，一管不加任何抗体作空白对照，另两管分别加入抗体CD44(Alexa Fluor 647)2 μL、CD45(FITC)2 μL并做好标记，4 ℃避光孵育35 min，1 000 r/min，4 ℃，离心5 min，无菌PBS清洗2遍后，制成500 μL单细胞悬液，移入专用管中，上机分析CD44、CD45表达情况与破骨细胞共培养体系的建立采用分离骨髓单核细胞的方法获得破骨细胞前体细胞，将出生14～20 d的实验大鼠断颈处死，取股骨和胫骨，剪开骨髓腔，用MEMα培养基多次冲洗，收集冲洗液，反复吹打，收集滤液，离心后弃上清液，保留细胞沉淀。将4 mL大鼠淋巴细胞分离液加入到离心管，其上加入已用4 mL MEMα重悬细胞沉淀；离心后吸取中间白膜层细胞到15 mL离心管内，加入10 mL PBS 稀释，再次离心，弃上清，保留细胞沉淀，用大鼠破骨细胞诱导培养基重悬细胞沉淀，按2×103/cm2种于6孔板的Transwell下室以破骨细胞诱导剂培养。将上述80%细胞融合的间充质干细胞制成细胞悬液，以1×104/cm2加入6孔板上的Transwell上室进行培养。下室于共培养第3、5、7天以破骨细胞诱导培养基重换液，第9天更换大鼠破骨细胞完全培养基进行培养，此后每3 d换药一次。上室以BMSCs培养液同步换液。根据BMSCs来源将共培养细胞分为：实验组+破骨细胞(OVXDF+OC)、模型组+破骨细胞(OVX+OC)、假手术组+破骨细胞(SHAM+OC)破骨细胞形态观察、鉴定及计数共培养后第3、7、12、16天于倒置相差显微镜下观察下室细胞形态。共培养后第12天对下室细胞进行HE及TRAP染色(根据TRAP染色染色试剂盒说明)酶联免疫吸附剂测定(ELISA)检测共培养体系中的OPG、RANKL情况共培养后第12天，收集Transwell下室细胞上清液，分别按照OPG、RANKL的ELISA试剂盒说明书操作，于450 nm波长检测各孔的光密度值并代入标准曲线计算蛋白质表达水平实时荧光定量PCR观察BMSCs Wnt10b、β-catenin、RANKL、OPG mRAN及RANKL/OPG共培养后第12天后，收集Transwell上室BMSCs，提取总RNA并检测纯度达标，取罗氏反转录试剂盒，按步骤冰上依次配置各组RNA反转录体系并于PCR仪中反应合成cDNA, 配置20 μL总体积的PCR反应体系(SYBR GreenⅠ10 μL，上游引物和下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，DEPC水7 μL)在LightCycler?480设备中进行实时荧光定量PCR反应条件：①预变性：95 ℃ 10 min 1个循环；扩增循环：②扩增 95 ℃ 10 s；③退火55 ℃ 10 s；④延伸72 ℃ 20 s，②至④为45个循环；溶解曲线：⑤95 ℃ 5s；⑥65 ℃ 60 s；⑦97 ℃ continous，⑤至⑦为1个循环；保温：40 ℃ 10 s 1个循环。实验结束后，导出记录各样本的ct值，在Excel中以β-actin作为内参基因对各组待测样品进行RNA总量校正，采用2-ΔΔct法计算各组基因的相对表达量，并进行统计学分析。目标基因引物序列见表1。表1引物序列Table1The sequences of primers基因序列产物长度(bp)Wnt10bF:5’-CCCCGGGACATCCAGGCGAGAAT-3’R:5’-GGACGTAGGCGGGGCTGGAAAACT-3’245β-catenin F:5’-TGGTGGGCTGCAGAAAATGGTT-3’R:5’-ACGATGGCCGGCTTGTTGC-3’246OPGF:5’-TCCCTTGCCCTGACTACTCTTAT-3’R:5’-GAACCCATCCGGACATCTTTT-3’260RANKLF:5’-CGAGCGCAGATGGATCCTAACAGA-3’R:5’-TCCCTTTGCACGGCCCCTTGAA-3’1791.9蛋白质印迹法(Western blot)观察Wnt10b、β-Catenin、RANKL、OPG的情况共培养后第12天，收集Transwell上室BMSCs，消化、离心、重悬、再离心，去上清，入含PMSF的裂解液，冰上持续裂解30 min，离心取上清，BCA法测定蛋白浓度，添加蛋白上样缓冲液(5×)，水浴锅100 ℃煮沸10 min，冰上降温，稍离心，-20 ℃保存，制备凝胶，依次进行转膜，封闭，用稀释后的Wnt10b、β-Catenin、OPG、RANKL、GAPOH抗体，摇床震荡1 h后，4 ℃条件下过夜，次日洗涤后二抗孵育1 h，洗涤，加入显影液孵育2 min，在Bio-Rad凝胶成像分析系统中曝光保存图像后，通过Image J软件对蛋白条带进行分析统计分析方法采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。数据以表示，各组间比较采用完全随机设计的方差分析，P<0.05 为差异具有统计学意义。2 结果2.1骨密度检查结果灌胃12周后，OVX、OVXDF组大鼠L4～5及双侧股骨骨密度较SHAM组明显下降，以OVX组最低，差异具有统计学意义(P<0.05)，表明造模成功(见图1)形态观察及鉴定形态观察：BMSCs培养至第3代时，细胞生长迅速，同时贴壁细胞成倍数增加，当细胞达到80%～90%融合时，其形态更加均一，呈纤维样或宽大扁平不规则样，排列密集紧凑，呈放射状或旋涡状(见图 2)。图1大鼠L4～5及双侧股骨骨密度 mineral density L4-5 and the bilateral femurs in rats图2各组大鼠BMSCs第3代细胞形态 A：SHAM组，B：OVXDF组，C：OVX组Fig.2The cell morphology of the third passage of BMSCs in rats of each group. A: SHAM; B: OVXDF; C: OVX2.2.2流式细胞仪检测：经流式分析检测，结果显示三组BMSCs CD44的表达率为阳性，CD45的表达率为阴性。结合培养时细胞形态学的观察，说明本实验采用全骨髓分离培养方法得到的BMSCs纯度较高，质量可靠。见图 3。图3流式细胞仪鉴定结果 of flow 破骨细胞的形态观察及鉴定2.3.1破骨细胞活体观察：倒置相差显微镜显示下室内单核细胞随着培养时间的延续逐渐融合呈周围有伪足，胞浆有空泡的多核细胞，数量逐渐增多，体积及细胞核数增多，在混合培养后第7～9天达到高峰。三组比较OVX+OC多核细胞出现最早，个数最多，凋亡时间最晚， OVXDF+OC组次之，SHAM+OC组最低。见图4。图4破骨细胞的形态观察 A：SHAM+OC组，B：OVXDF+OC组，C：OVX+OC组 observation of osteoclasts. A: SHAM+OC; B: OVXDF+OC; C: OVX+OC2.3.2破骨细胞的鉴定及计数：HE染色可见破骨细胞呈浅粉红色，体积较大，胞浆颗粒均匀、细小，核仁染色呈浅蓝色，可见多个细胞核，细胞膜周围可见伪足(图5A)。TRAP染色观察见破骨细胞体积较大，呈酒红色，胞质均匀，可见多核，核呈蓝色。周围可见伪足(图5B)。TARP染色(+)、细胞核内可见多核，表明诱导所得细胞为破骨细胞。在200倍镜下随机分析10个视野的TRAP(+)且胞内≥3个细胞核的多核细胞数，显示与去卵巢后灌胃大鼠BMSCs共培养的破骨细胞(OVXDF+OC)数量较单纯模型组+破骨细胞(OVX+OC)明显减少。三组比较，SHAM+OC组<OVXDF+OC组<OVX+OC，差异具有统计学意义(P<0.05)(图5C)。图5破骨细胞鉴定及计数 and counting of osteoclasts下室培养液中OPG、RANKL的含量模型组+破骨细胞(OVX+OC)中抑制骨吸收的OPG含量最低，促进破骨细胞分化及成熟的RANKL含量最高。经骨碎补灌胃后(OVXDF+OC)，OPG含量明显升高，RANKL含量明显降低。三组比较，OPG含量：SHAM+OC组>OVXDF+OC组>OVX+OC组，差异具有统计学意义(P<0.05)；RANKL含量：SHAM+OC组<OVXDF+OC组<OVX+OC组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图6。图6各组大鼠OPG、RANKL含量Fig.6The content of OPG, RANKL in rats of each 中Wnt10b、β-catenin OPG、RANKL mRNA测量模型组+破骨细胞(OVX+OC)中Wnt10b、β-catenin、OPG mRNA相对量最低，RANKL mRNA相对量及RANKL/OPG最高，灌胃后(OVXDF+OC)Wnt10b、β-catenin、OPG mRNA升高，RANKL mRNA、RANKL/OPG降低。三组比较，Wnt10b、β-catenin、OPG mRNA：SHAM+OC组>OVXDF+OC组>OVX+OC组，差异具有统计学意义(P<0.05)。RANKL mRNA、RANKL/OPG：SHAM+OC组<OVXDF+OC组<OVX+OC组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图7。图7各组大鼠Wnt10b、β-catenin、OPG、RANKL mRNA表达 expression of Wnt10b, beta-catenin, OPG, and RANKL in rats of each 中Wnt10b、β-catenin、OPG、RANKL蛋白表达情况模型组+破骨细胞(OVX+OC)中Wnt10b、β-catenin、OPG蛋白表达最低，RANKL蛋白表达及RANKL/OPG最高，灌胃后(OVXDF+OC)Wnt10b、β-catenin、OPG蛋白表达升高，RANKL蛋白表达及RANKL/OPG降低。三组比较，Wnt10b、β-catenin、OPG蛋白表达：SHAM+OC组>OVXDF+OC组>OVX+OC组，差异具有统计学意义(P<0.05)。RANKL蛋白表达及RANKL/OPG：SHAM+OC组<OVXDF+OC组<OVX+OC组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图8。3 讨论3.1BMSCS与骨质疏松症图8各组大鼠Wnt10b、β-catenin、OPG、RANKL 蛋白表达 expression of Wnt10b, beta-catenin, OPG, and RANKL in rats of each group随着老龄社会的到来，骨质疏松症已成为世界性健康问题，其原因在于骨形成与骨吸收之间的失耦联。既往对骨质疏松症的研究多集中在成骨细胞、破骨细胞及其相互关系[6]，随着研究的深入，与成骨细胞及破骨细胞共存于骨骼微环境中的BMSCs对骨代谢的作用逐渐得到重视[7-9]。BMSCs是一种具有多种分化潜能的成纤维样细胞，在不同微环境下具有向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化的能力，有骨修复潜能[10]，在此过程中，Wnt/β-catenin信号通路起重要作用。研究表明，激活Wnt/β-catenin信号通路可提高成骨关键因子RUNX2的表达[11-12]，促进间充质干细胞的成骨分化[13]，抑制其成脂及成软骨分化。同时，BMSCs还可通过多种途径调控破骨细胞的分化、成熟及活性[14-16]，其中，OPG/RANKL/RANK信号通路是重要途径之一。OPG和核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)主要由成骨细胞、骨髓间充质干细胞分泌。RANKL可以与破骨细胞膜上的核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-KB，RANK)相结合，激活RANKL/RANK信号通路，调控破骨细胞的分化、成熟及活性。OPG亦可以与RANK相结合，与RANKL相竞争性，阻断RANKL/RANK信号通路的传导，起到抑制破骨细胞的作用。研究表明，在无或低浓度破骨细胞诱导因子的情况下，BMSCs与破骨细胞前体细胞共同培养可促进破骨细胞的形成[17]；而在高浓度破骨细胞诱导因子作用下，BMSCs对破骨细胞的分化、成熟起抑制作用[18]。表明BMSCs对破骨细胞具有双重作用，而骨骼微环境会影响其对破骨细胞的调控骨碎补防治骨质疏松骨碎补为水龙科植物槲蕨 Drynaria fortunei(Kunze)J.Sm的干燥根茎，在祖国医学中，首见于《药性论》，其性味苦、温，归肝、肾经，具有活血续伤、补肾强骨的功效，主治跌打损伤或创伤，筋骨损伤，瘀滞肿痛；以及肾虚腰痛脚弱，耳鸣耳聋，牙痛，久泻等。常用剂量为9～20 g，是目前治疗骨质疏松症常用中药之一[19]。现代药理学研究发现其主要生物活性成分是黄酮类化合物，而柚皮苷又是其黄酮类化合物的主要成分[20]。研究表明，骨碎补及其提取物可通过改善微循环[21]，调节雌激素[22]、调节细胞的增值分化[23-24]及调节信号通路等多种机制，防治骨质疏松。其中，Wnt/β-catenin和OPG/RANKL/RANK信号通路无疑是其调控的重要途径。骨碎补及其提取物可以激活Wnt/β-catenin信号通路，促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，抑制其成脂分化[25-26]，通过OPG/RANKL/RANK调节破骨细胞引起的骨吸收[27-28]骨碎补通过调节BMSCs分泌OPG、RANKL调控破骨细胞的分化成熟本实验发现OVX+OC组中破骨细胞出现最早，个数最多，凋亡时间最晚，OVXDF+OC组次之，SHAM+OC组最低。表明在存在破骨细胞诱导剂的情况下，与正常大鼠BMSCs相比，绝经后大鼠BMSCs对破骨细胞分化成熟的抑制作用减弱，而经骨碎补灌胃后的绝经后大鼠BMSCs对破骨细胞的分化成熟的抑制作用得到加强，显示骨碎补可以通过BMSCs来抑制破骨细胞的分化及成熟。共培养系统中上清液以及BMSCs内，RANKL RANKL/OPG：SHAM+OC组<OVXDF+OC组<OVX+OC组；OPG：SHAM+OC组>OVXDF+OC组>OVX+OC组，表明绝经后骨质疏松大鼠BMSCs内及其分泌的OPG降低，而RANKL升高，RANKL/OPG比例升高，从而激活OPG/RANKL/RANK信号通路促进破骨细胞的分化、成熟。经骨碎补灌胃后，OPG升高，RANKL降低，RANKL/OPG比例降低，抑制OPG/RANKL/RANK信号通路，抑制破骨细胞的分化、成熟。同时，灌胃后大鼠BMSCs中Wnt10b及β-catenin mRAN及蛋白含量升高，提示在此过程中骨碎补同时激活了Wnt/β-catenin信号通路。虽然具体作用机制尚不明确[29]，但众多研究表明Wnt/β-catenin通路的激活可升高OPG，降低RNAL[30-31]，因此，推测骨碎补调节BMSCs OPG及RANKL可能与Wnt/β-catenin通路的激活有关。由于OPG、RANKL的分泌受多种机制调控，实验过程中OPG、RANKL的变化是否仅仅由Wnt/β-catenin信号通路的激活引起，是否有其他机制协同作用，尚不明确，还需一步研究。【参考文献】[1] Li CJ,Cheng P,Liang MK,et regulates age-related switch between osteoblast and adipocyte differentiation[J].J clin invest, 2015,125(4):1509-1522.[2] 宋渊,李盛华,何志军.骨碎补含药血清对成骨细胞增殖、成骨的影响[J].中国骨质疏松杂志,2014,20(2):125-128,170.[3] 薛海鹏,刘国岩,吴燕,等.骨碎补促进骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化[J].中国矫形外科杂志,2018,26(11):1035-1040.[4] 李风波,孙晓雷,马剑雄,等.柚皮苷对破骨细胞分化的影响[J].中国中药杂志, 2015,40(2):308-312.[5] 李明, 吕厚辰, 尹鹏滨, 等. 两种卵巢切除术式建立大鼠骨质疏松模型的优势比较[J]. 解放军医学院学报, 2015(04):383-387.[6] Simon D,Derer A,Andes FT,et as a novel regulator of osteoblast-osteoclast interaction and bone homeostasis[J].Bone,2017,105:35-41.[7] 徐丽丽,胥方元,万永鲜.人bmscs自噬水平和成骨分化能力比较[J].中国骨质疏松杂志, 2018,24(11):1446-1450,1463.[8] 任磊,代光明,林枭,等.骨细胞wnt/β-catenin通过notch信号促进bmscs成骨分化[J]. 中国骨质疏松杂志,2018,24(5):600-605.[9] 张丽媛,纳青青,吴天秀,等.Orexin-1受体抑制剂通过wnt通路促进骨髓间充质干细胞的成骨分化[J].中国骨质疏松杂志,2017,23(5):606-611.[10] Wang L,Wang L,Cong X,et al.Human umbilical cord 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文章来源：《云南中医中药杂志》 网址: http://www.ynzyzyzz.cn/qikandaodu/2020/1004/469.html