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骨碎补经骨髓间充质干细胞调节OPG/RANKL/RANK

来源:云南中医中药杂志 【在线投稿】 栏目:期刊导读 时间:2020-10-04 04:05

【作者】:网站采编

【关键词】:

【摘要】骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种以骨量减低、骨细微结构退化,骨强度降低为特征的骨代谢疾病。2010-2016年,我国老年人的整体发病率是36%,而在绝经后老年女性的发病率高达49%[1],严

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种以骨量减低、骨细微结构退化,骨强度降低为特征的骨代谢疾病。2010-2016年,我国老年人的整体发病率是36%,而在绝经后老年女性的发病率高达49%[1],严重影响中老年人的健康。骨碎补是一味治疗骨质疏松的常用中药,可以促进成骨[2-3];也可以抑制破骨细胞的分化及成熟[4],但具体作用机制尚不完全明确。在本实验中,笔者研究骨碎补对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrowstromal cells,BMSCs)Wnt/β-Catenin及OPG/RANKL/RANK信号通路的影响,及其对破骨细胞分化、成熟的作用,并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物

分离BMSCs用实验动物,为6月龄健康雌性SD大鼠(SPF级),体重(315.) g,诱导培养破骨细胞用实验动物,为出生14~20 d的SD大鼠。均购自朋悦(济南)公司,合格证号:SCXK(鲁)。

1.2试剂耗材

低糖DMEM培养基(DMEM-LG)(美国Hyclone公司)、胎牛血清(FBS)(美国Hyclone 公司)、0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA(美国Hyclone 公司)、TRIpure Reagent(批号AX,北京艾德莱生物科技有限公司)、Wnt10b、β-Catenin、OPG、RANKL及GAPDH抗体(Abcam公司)、辣根酶标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥)、伊红染色液、苏木素染色液(上海碧云天生物技术有限公司)、OPG、RANKL ELISA试剂盒(武汉基因美公司)、大鼠破骨细胞诱导培养基、大鼠破骨细胞完全培养基(武汉普诺赛公司)。

1.3主要仪器设备

研究用万能级显微镜(OLYMPUS,日本奥林巴斯公司)、CO2培养箱(上海力康发展有限公司)、实时荧光定量PCR 仪(LightCy-cler480II,瑞士)、酶联免疫仪(Biotek Elx800,美国伯腾仪器有限公司),微量紫外可见光分光光度计(凯奥/K5600,北京凯奥科技发展有限公司)、温度梯度PCR仪(TP600,日本TAKARA)、垂直蛋白电泳仪(VE-,上海天能)、流式细胞仪(FACSVE RSE,美国BD)、多色荧光成像系统(Fusion Fx7,法国VILBER)、Transwell 小室(北京康宁公司,中国)。

1.4实验方法

1.4.1动物分组、造模及鉴定:背侧双切口切除双侧卵巢建立骨质疏松模型[5],假手术组仅摘除卵巢周围少量脂肪组织。术后适应性饲养8周,健康大鼠随机分为3组,各组16只,分为实验组(OVXDF)、模型组(OVX)、假手术组(SHAM)。实验组参考本课题组前期实验[3],根据动物与人体的每千克体重剂量折算后,按照4.8 g/只剂量给予骨碎补水煎液灌胃(相当于人体千克体重每日用药的10倍),模型组及假手术组用0.9%生理盐水3.0 mL/只灌胃,每日两次,连续12周。灌胃结束时将大鼠麻醉,使用MEDILINK-MEDIX90骨密度仪自带软件测量大鼠L4~5、双侧股骨骨密度。

的分离培养、形态观察及鉴定:(1)BMSCs分离及培养。采用全骨髓贴壁筛选法进行BMSCs的分离及培养,倒置相差显微镜观察细胞增殖及形态变化并拍照,待原代细胞增殖到90%融合时,按1∶3比例进行传代,继续培养,待细胞增殖到90%融合时,再次传代培养。(2)BMSCs鉴定。取各组融合状况优良的P3代BMSCs,消化、离心,弃上层液体,无菌PBS漂洗2遍,用2 mL PBS重悬细胞,平均分配到3个1.5 mL的EP管中,一管不加任何抗体作空白对照,另两管分别加入抗体CD44(Alexa Fluor 647)2 μL、CD45(FITC)2 μL并做好标记,4 ℃避光孵育35 min,1 000 r/min,4 ℃,离心5 min,无菌PBS清洗2遍后,制成500 μL单细胞悬液,移入专用管中,上机分析CD44、CD45表达情况。

1.5BMSCs与破骨细胞共培养体系的建立

采用分离骨髓单核细胞的方法获得破骨细胞前体细胞,将出生14~20 d的实验大鼠断颈处死,取股骨和胫骨,剪开骨髓腔,用MEMα培养基多次冲洗,收集冲洗液,反复吹打,收集滤液,离心后弃上清液,保留细胞沉淀。将4 mL大鼠淋巴细胞分离液加入到离心管,其上加入已用4 mL MEMα重悬细胞沉淀;离心后吸取中间白膜层细胞到15 mL离心管内,加入10 mL PBS 稀释,再次离心,弃上清,保留细胞沉淀,用大鼠破骨细胞诱导培养基重悬细胞沉淀,按2×103/cm2种于6孔板的Transwell下室以破骨细胞诱导剂培养。将上述80%细胞融合的间充质干细胞制成细胞悬液,以1×104/cm2加入6孔板上的Transwell上室进行培养。下室于共培养第3、5、7天以破骨细胞诱导培养基重换液,第9天更换大鼠破骨细胞完全培养基进行培养,此后每3 d换药一次。上室以BMSCs培养液同步换液。根据BMSCs来源将共培养细胞分为:实验组+破骨细胞(OVXDF+OC)、模型组+破骨细胞(OVX+OC)、假手术组+破骨细胞(SHAM+OC)。

1.6破骨细胞形态观察、鉴定及计数

共培养后第3、7、12、16天于倒置相差显微镜下观察下室细胞形态。共培养后第12天对下室细胞进行HE及TRAP染色(根据TRAP染色染色试剂盒说明)。

文章来源:《云南中医中药杂志》 网址: http://www.ynzyzyzz.cn/qikandaodu/2020/1004/469.html

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